Avaliação de sinergia entre epímeros de fenilseptinas e piscidinas 2 sobre suas atividades antibacterianas e interações com membranas

Abstract

Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são amplamente estudados como novas substâncias alternativas ou complementares aos antibióticos convencionais usados no tratamento de doenças infecciosas, principalmente aquelas emergentes de bactérias resistentes. Em geral, estes peptídeos atuam na membrana bacteriana e sua composição e conformações que adquirem ao interagirem com bicamada fosfolipídicas, desempenham um papel crucial em suas atividades biológicas. A configuração dos resíduos de aminoácidos presentes na estrutura primária também exerce um papel importante na atividade antimicrobiana dessas moléculas. Embora a grande maioria dos PAMs naturais são constituídos de aminoácidos em configuração L, a ocorrência de aminoácidos D tem sido relatada para algumas moléculas. Neste trabalho, é avaliada a existência de sinergia em relação ao efeito antibacteriano entre os epímeros D e L das fenilseptinas e das piscidinas 2. Os epímeros das fenilseptinas (D- e L-Phes) são peptideos antimicrobianos naturais, originalmente isolados da pele do anuro Hypsiboas punctatus, compostos por 18 resíduos de aminoácidos (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2). A epimerização ocorre no segundo resíduo de fenialanina (F) na porção N-terminal, sendo o epímero D mais ativo contra bactérias gram-positivas e gram-negativas em relação ao empímero L. A piscidina 2 (ecPis2s) é um peptídeo antimicrobiano isolado dos órgãos do peixe Epinephelus coioides, e contêm 20 resíduos de aminoácidos (FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV-NH2). Coincidentemente, sua estrutura primária também apresenta três resíduos de fenilalanina na região N-terminal como observado nas fenilseptinas. Baseando-se em resultados já conhecidos para os epímeros das fenilsepitinas, neste trabalho foi proposta a síntese do epímero D de ecPis2s, mudando-se a configuração do resíduo de F. O comportamento sinérgico das formulações contendo os epímeros de fenilseptinas e piscidinas 2 foi avaliado em ensaios antibacterianos, ensaio de sinergismo por “tabuleiro de damas” (do inglês checkboard), estudos de toxicidade in vivo, e citotoxicidade in vitro. Além disso, foram realizados estudos de interação com vesículas fosfolipídicas de POPC:POPG (3:1, mol/mol) pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e de atividade lítica com vesículas fosfolipídicas de POPG:CL (2:1, mol/mol) contendo calceína encapsulada. Os dados do ensaio de sinergismo demonstram que as fenilseptinas apresentam um comportamento sinérgico com um ICIF de 0,125, sendo as formulações D-/L-Phes (1:32, mol/mol) e D-/L-Phes (4:1, mol/mol) as mais promissoras dentre as testadas (2 e 4 μg/mL respectivamente). Os dados de atividade lítica mostraram que as formulações D-/L-Phes (1:32, mol/mol) e D-/L-Phes (4:1, mol/mol) também resultaram em maiores percentuais de calceína liberada (95% e 96% respectivamente) do que os epímeros individuais. O ensaio de sinergismo para as piscidinas 2 revelaram um efeito aditivo da sua combinação com um ICIF de 1. A formulação de D-/L-ecPis2s (2:1, mol/mol) apresentou um comportamento similar a das fenilseptinas, com uma maior atividade contra cepas de Salmonella typhymurium (MIC de 50 μM). Os estudos de interação com vesícula mostraram um Kapp de 19,8.10³ M-¹, e os estudos de atividade lítica descreveram, em ambos os casos. parâmetros superiores aqueles encontrados para os epímeros isolados. Tanto as formulações quanto os epímeros individuais das fenilseptinas e piscidinas 2 apresentaram uma baixa viabilidade celular. Contudo os ensaios in vivo, descrevem uma toxicidade baixa para os tenébrios com taxa de 100% de sobrevivência para L-ecPis2s e D-/L-ecPis2s (1:1, mol/mol) e de 80% para a formulação de D-/L-Phes (4:1, mol/mol). Esses resultados demonstram que para ambos pares de epímeros dos peptídeos estudados uma combinação de epímeros contribui para uma maior atividade antibacteriana e interação com membranas, além de uma redução nas suas toxicidades em comparação aos peptídeos isolados.