Desenvolvimento de um imunosensor para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi por meio da espectroscopia de ressonância de plásmons de superfície

Abstract

O objetivo desse trabalho foi desenvolver um imunosensor fundamentado em espectroscopia de ressonância de plásmons de superfície (SPR) para a detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi por meio da imobilização de antígenos brutos do parasito em monocamadas auto-organizadas mistas (SAMs) formadas por ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA) e ácido 3-mercaptopropiônico (3-MPA). Na sua construção, as concentrações de cada alcanotiol, bem como a proporção de cada um deles na composição das SAMs mistas foram definidas através de cálculos de cobertura de superfície Posteriormente, o antígeno em diferentes concentrações foi imobilizado sobre as SAMs mistas ativadas construídas em disco de ouro e, a variação do ângulo de SPR (∆θSPR) decorrente dessa etapa foi monitorada em tempo real. O imunosensor desenvolvido foi então eletroquimicamente caracterizado por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e as respostas do mesmo frente a um pool de soros de indivíduos infectados e não infectados pelo T. cruzi foram avaliadas. Em seguida, foram determinados parâmetros para otimização do dispositivo, incluindo tempo de imobilização e concentração do antígeno, bloqueio e regeneração da superfície sensora e tempo envolvido nas análises do imunoensaio. Por fim, a diluição de trabalho do soro e o ponto de corte do imunosensaio foram escolhidos e os índices de desempenho do mesmo como técnica para o imunodiagnóstico da DC foram calculados empregando 171 soros, sendo 99 de indivíduos infectados pelo T. cruzi, 30 de não infectados e 42 portadores de outras infecções. Os maiores valores de foram encontrados para a concentração 1.0 mmol L-1 de 11-MUA e 3-MPA e para as SAMs mistas formadas na proporção de 1:10. A imobilização dos antígenos foi conduzida com êxito, de modo que houve linearidade entre a concentração utilizada e o ∆θSPR. Por VC e EIE, foi demonstrado que a ligação covalente das proteínas aumentou a resistência à transferência eletrônica quando comparado com o comportamento da sonda eletroquímica sobre as SAMs mistas. Ademais, o imunosensor se mostrou, semelhante ao ELISA, capaz de detectar anticorpos anti-T. cruzi em amostras de soros diluídas até 1280 vezes. Já em relação aos soros negativos, o dispositivo detectou ∆θSPR significativas apenas até a diluição 1:160, o que demonstrou razoável capacidade do método em distinguir indivíduos infectados de não infectados. Dentre os parâmetros analíticos avaliados ficou definido o tempo de imobilização e a concentração do antígeno em 20 minutos e 30 µg mL-1, o bloqueio da superfície por 10 minutos com solução de BSA 1.0%, a regeneração pela injeção de SDS 1.0% e o tempo de avaliação da resposta do dispositivo em 20 minutos. A diluição do soro em 1:320 e o ponto de corte a 17.2 mº foram os critérios metodológicos definidos para o imunosensaio. Os índices de desempenho calculados determinaram um excelente potencial do imunosensor no diagnóstico sorológico da doença de Chagas, com valores de sensibilidade de 100%, especificidade de 97.2%, valor preditivo positivo igual a 98%, valor preditivo negativo de 100% e acurácia global estimada em 99.6%. O número de reações cruzadas em soros de indivíduos com leishmaniose visceral foi menor no método proposto (1/7) do que no ELISA (6/7). A partir dos resultados é possível afirmar que foi desenvolvido com êxito um imunosensor sensível, específico, rápido, simples e de fácil execução para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas.