Síntese, estudos estruturais, conformacionais e de interação do peptídeo antimicrobiano HSP-1 em meios biomiméticos

Abstract

Micro-organismos resistentes a antibióticos vêm atingindo índices elevados nos últimos anos, agravando problemas de saúde pública e econômicos. O impacto na sociedade devido à resistência de bactérias aos antibióticos convencionais tem mobilizado a pesquisa para o desenvolvimento de novas drogas. Nesse contexto, surgem os peptídeos antimicrobianos, que são moléculas efetoras do sistema imune inato e podem ser encontrados em praticamente todos os seres vivos. Para proteção contra os micro-organismos presentes em seu habitat, a pele de anuros apresenta um verdadeiro arsenal químico, constituído, em sua maioria, de diferentes classes de peptídeos. Dentre esses, os antimicrobianos são considerados os mais avançados participantes do sistema imunológico. Vários estudos sugerem que os peptídeos antimicrobianos podem atuar por diferentes mecanismo como micelização, formação de poros na superfície da membrana ou, ainda, pelo ataque a algum alvo intracelular. Embora a maioria dos modelos existentes proponham que peptídeos antimicrobianos exercem suas atividades biológicas por meio da interação com a membrana bacteriana, o mecanismo de ação dessas moléculas ainda não é completamente compreendido. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo obter informações estruturais, conformacionais e de interação em ambientes que mimetizam membranas biológicas, do peptídeo Hylaseptina P1 (HSP-1), composto por 14 resíduos de aminoácidos e isolado do anuro da espécie Hyla punctata visando o entendimento do seu mecanismo de ação. Neste trabalho, o peptídeo HSP-1 foi sintetizado manualmente através da síntese de peptídeos em fase sólida via estratégia Fmoc. As preferências conformacionais do peptídeo em meios micelares de dodecilsulfato de sódio (SDS), dodecilfosfocolina (DPC) e vesículas fosfolipídicas de 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (PC) e 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (PG) foram avaliadas por Dicroísmo Circular. Observou-se que em meio aquoso HSP-1 adota estrutura desenovelada, enquanto que, em meios micelares e vesículas fosfolipídicas, apresentou conformação -hélice. A estrutura tridimensional foi estudada na presença de micelas de SDS e DPC por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear em solução, revelando que, em micelas de SDS o peptídeo HSP-1 exibe conformação helicoidal mais prolongada do que em micelas de DPC, no qual foi possível verificar pequena dobra da hélice na região N-terminal da cadeia peptídica, sugerindo maior inserção do peptídeo em micelas zwiteriônicas. O efeito da adição de peptídeo no tamanho e na carga superficial de vesículas fosfolipídicas de PC e PC:PG (3:1) foi investigado por medidas de espalhamento de luz dinâmica e Potencial Zeta. Verificou-se que a adição de HSP-1 resulta no aumento do diâmetro hidrodinâmico (ΔDh ≈ 20 nm) e aumento do potencial Zeta (Δζ ≈ 15 mV) de vesículas unilamelares (LUV’s) de PC:PG, indicando interação eletrostática com a superfície das vesículas. Quando vesículas de PC foram tituladas com HSP-1, foi observada maior alteração no diâmetro hidrodinâmico das LUVs (ΔDh ≈ 22 nm), enquanto que não se observaram alterações significativas nos valores de potencial Zeta (Δζ ≈ 0 mV), sendo indicativo de uma maior inserção do peptídeo em membranas zwiteriônicas. Conforme observado nos resultados de Calorimetria de Titulação Isotérmica, a interação com vesículas zwiteriônicas foi da ordem de 102 maior do que o valor encontrado para interação com vesículas negativas. Contudo, os dados termodinâmicos revelaram a predominância de interações eletrostáticas de HSP-1 com vesículas de PC:PG e hidrofóbicas com vesículas de PG. Finalmente, a capacidade de formação de poros de HSP-1 foi examinada por meio de medidas de extravasamento de carboxifluoresceína (CF) em vesículas de PC e PC:PG. Em PC-LUVs observou-se uma maior intensidade de fluorescência em comparação com PC:PG-LUVs, sugerindo uma maior atividade lítica do peptídeo em vesículas zwiteriônicas. A porcentagem máxima de CF liberada foi superior em LUVs-PC (65%) quando comparado a LUVs de PC:PG (50%), confirmando que HSP-1 tem maior capacidade de permeabilização em meio zwiteriônico. Os dados de extravasamento demostraram também menor cinética de liberação de CF em PC-LUVs, condizente com um mecanismo no qual há maior inserção do peptídeo na interface da bicamada lipídica, e maior cinética de liberação de CF em PC:PG-LUVs, de acordo com um mecanismo tipo carpete, o qual envolve apenas interação superficial do peptídeo com a membrana.