Proteoma comparativo da região cambial de clones de Eucalyptus spp. e Corymbia spp. cultivados em diferentes espaçamentos

Abstract

Diferenças fenotípicas observadas entre árvores cultivadas em diferentes espaçamentos de plantio, no que se refere a propriedades da madeira, podem ser atribuídas a uma diferença no padrão de abundância de proteínas no xilema secundário. Para entender em nível molecular como o espaçamento afeta o crescimento e a formação da madeira de um hibrido tri-cross de Eucalyptus urophylla S.T. Blake x (E. camaldulensis Dehn x E. grandis Hill ex Maiden) e de um híbrido de Corymbia citriodora (Hook) K. D. Hill & L. A. Johnson x C. torelliana (F. Muell) K. D. Hill & L. A. Johnson, uma abordagem proteômica foi empregada neste trabalho. Para isso, amostras do tecido cambial foram coletadas de clones, com 24 meses de idade, cultivados em quatro diferentes espaçamentos (3 x 3 m, 3 x 1 m, 6 x 1,5 m e 6 x 0,5 m). Diferentes protocolos foram comparados para extração das proteínas, sendo eles os métodos baseados no uso de TCA/acetona, TCA/acetona/fenol e solução tampão/fenol/acetato de amônio em metanol. As proteínas totais do tecido cambial foram separadas mediante eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Afim de promover um ensaio sensitivo e acurado, a proteômica do tipo “shotgun” (nLC-MS/MSOrbitrap) foi a estratégia adotada. Para a identificação de proteínas, foram utilizados bancos de dados públicos de Eucalyptus grandis. As proteínas identificadas nos bancos de dados, quando não caracterizadas, foram funcionalmente anotadas com base na similaridade com sequências anotadas no UniRef90, usando o Sma3s. Por fim, as proteínas com diferença significativa (p<0,05) diferencialmente reguladas (fold-change entre 2 e 0,5) foram funcionalmente categorizadas usando a ferramenta MERCATOR-MapMan. Além disso, esse grupo de proteínas foi mapeado nos processos biológicos da base de dados Kegg. De modo geral, proteínas extraídas com solução tampão combinada com fenol e precipitadas com acetato de amônio em metanol apresentaram melhor qualidade, alto rendimento e bandas com melhores intensidades, em comparação com os outros métodos de extração, sendo este o método de extração usado. A análise eletroforética unidimensional revelou alterações no perfil proteico do câmbio vascular dos clones de Eucalyptus e Corymbia submetidos a diferentes espaçamentos de plantio. A estratégia de proteômica “shotgun” identificou 2547 espécies proteicas, das quais 1484 apresentaram diferenças significativas e mudanças qualitativas ou quantitativas em resposta a clones e espaçamentos de plantio. A análise estatística das proteínas identificadas e dos processos biológicos relacionados revelaram um comportamento diferente nos clones em relação à abundância de suas proteínas indicando um possível ajuste metabólico em função das condições ambientais proporcionadas pelos espaçamentos de plantio avaliados que refletiu nas características da madeira das referidas espécies.